Современные методы анализа лекарственных средств. Исследование качества лекарственных средств. Реакции нейтрализации и разложения анионов
В соответствии с ГФ XI методы исследования лекарственных средств подразделяются на физические, физико-химические и химические.
Физические методы. Включают методы определение температуры плавления, затвердевания, плотности (для жидких веществ), показателя преломления (рефрактометрия), оптического вращения (поляриметрия) и др.
Физико-химические методы. Их можно разделить на 3 основным группы: электрохимические (полярография, потенциометрия), хромато- графические и спектральным (УФ- и ИК-спектрофотометрия и фотоколориметрия).
Полярография - метод изучения электрохимических процессов, основанный на установлении зависимости силы тока от напряжения, которое прикладывается к исследуемой системе. Электролиз исследуемых раство- ров проводится в электролизере, одним из электродов которой служит капельный ртутный электрод, а вспомогательным - ртутныш электрод с большой поверхностью, потенциал которого практически не изменяется при прохождении тока небольшой плотности. Полученная полярографическая кривая (полярограмма) имеет вид волны. Вымота волны связана с концентрацией реагирующих веществ. Метод применяется для количественного определения многих органических соединений.
Потенциометрия - метод определения рН и потенциометрическое титрование.
Хроматография - процесс разделения смесей веществ, происходящий при их перемещении в потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента. Разделение происходит благодаря различию тех или иныгх физико -химических свойств разделяемые веществ, приводящему к неодинаковому взаимодействию их с веществом неподвижной фазы, следовательно, к различию во времени удерживания слоя сорбента.
По механизму, лежащему в основе разделения, различают адсорбционную, распределительную и ионообменную хроматографию. По способу разделения и применяемой аппаратуре различают хроматографию на колонках, на бумаге в тонком слое сорбента, газовую и жидкостную хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и др.
Спектральным методы основаны на избирательном поглощении электромагнитного излучения анализируемым веществом. Различают спектрофотометрические методы, основанным на поглощении веществом монохроматического излучения УФ- и ИК-диапазонов, колориметрические и фотоколориметрические методы, основанным на поглощении веществом немонохроматического излучения видимой части спектра.
Химические методы. Основаны на использовании химических реакций для идентификации лекарственные средств. Для неорганических лекарственных средств используют реакции на катионы и анионы, для органических - на функциональным группы, при этом применяются только такие реакции, которым сопровождаются наглядным внешним эффектом: изменением окраски раствора, выделением газов, выпадением осадков и т.д.
С помощью химических методов проводят определение численных показателей масел и эфиров (кислотное число, йодное число, число омыления), характеризующих их доброкачественность.
К химическим методам количественного анализа лекарственных веществ относятся гравиметрический (весовой) метод, титриметрические (объёмным) методы, включающие кислотно - основное титрование в водных и неводных средах, газометрический анализ и количественный элементный анализ.
Гравиметрический метод. Из неорганических лекарственных веществ этим методом можно определять сульфаты, переводя их в нераство- римым соли бария, и силикаты, предварительно прокаливая их до диоксида кремния. Возможно применение гравиметрии для анализа препаратов со - лей хинина, алкалоидов, некоторые витаминов и др.
Титриметрические методы. Это наиболее распространенным в фар - мацевтическом анализе методы, отличающиеся небольшой трудоемкостью и достаточно вымокой точностью. Титриметрические методы можно подразделить на осадительное титрование, кислотно - основное, окислительно - восстановительное, комплексиметрию и нитритометрию. С их помощью количественную оценку производят, проводя определение отдельные элементов или функциональных групп, содержащихся в молекуле лекарственного вещества.
Осадительное титрование (аргентометрия, меркуриметрия, меркуро- метрия и др.).
Кислотно - основное титрование (титрование в водной среде, ацидиметрия - использование в качестве титранта кислоты, алкалиметрия - использование для титрования щелочи, титрование в смешанные растворителях, неводное титрование и др.).
Окислительно-восстановительное титрование (иодометрия, иодхлорометрия, броматометрия, перманганатометрия и др.).
Комплексиметрия. Метод основан на образовании прочных, растворимых в воде комплексов катионов металлов с трилоном Б или др. комплексонами. Взаимодействие происходит в стехиометрическом соотношении 1:1 независимо от заряда катиона.
Нитритометрия. Метод основан на реакциях первичных и вторичных ароматических аминов с нитритом натрия, которые используют в качестве титранта. Первичные ароматические амины образуют с нитритом натрия в кислой среде диазосоединение, а вторичным ароматические амины в этих условиях образуют нитрозосоединения
Газометрический анализ. Имеет ограниченное применение в фармацевтическом анализе. Объектами этого анализа являются два газообразныгх препарата: кислород и циклопропан. Сущность газометрического определения заключается во взаимодействии газов с поглотительными растворами.
Количественный элементный анализ. Этот анализ используют для количественного определения органических и элементорганических со - единений, содержащих азот, галогены, серу, а также мы1шьяк, висмут, ртуть, сурьму и др. элементы.
Биологические методы контроля качества лекарственных веществ. Биологическую оценку качества ЛB проводят по их фармакологической активности или токсичности. Биологические микробиологические методы применяют в тех случаях, когда с помощью физических, химических и физико-химических методов нельзя сделать заключение о доброкачественности ЛC. Биологические испытания проводят на животных кошки, собаки, голуби, кролики, лягушки и др.), отдельных изолированных органах (рог матки, часть кожи) и группах клеток (форменные элементы крови, штаммы микроорганизмов и др.). Биологическую активность устанавливают, как правило, путем сравнения действия испытуемых и стандартных образцов.
Испытаниям на микробиологическую чистоту подвергают не стерилизуемые в процессе производства ЛП (таблетки, капсулы, гранулы, растворы, экстракты, мази и др.). Эти испытания имеют своей целью определение состава и количества имеющейся в ЛФ микрофлоры. При этом устанавливается соответствие нормам, ограничивающим микробную обсемененность (контаминацию). Испытание включает количественное определение жизнеспособных бактерий и грибов, выявление некоторых видов микроорганизмов, кишечной флоры и стафилококков. Испытание выполняют в асептических условиях в соответствии с требованиями ГФ XI (в. 2, с. 193) двухслойным агаровым методом в чашках Петри.
Испытание на стерильность основано на доказательстве отсутствия в ЛС жизнеспособных микроорганизмов любого вида и является одним из важнейших показателей безопасности ЛС. Этим испытаниям подвергаются все ЛП для парентерального введения, глазные капли, мази и т.д. Для контроля стерильности применяют биогликолевую и жидкую среду Сабуро, используя метод прямого посева на питательные среды. Если ЛС обладает выраженным антимикробным действием или разлито в емкости более 100 мл, то используют метод мембранной фильтрации (ГФ, в. 2, с. 187).
УДК 615.015:615.07:53
АНАЛИЗ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ПРИ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЯХ
Дмитрий Владимирович Рейхарт1, Виктор Владимирович Чистяков2
Кафедра организации и управления в сфере обращения лекарственных средств (зав. - чл.-корр. РАМН, проф. Р.У. Хабриев) Московской государственной медицинской академии им. И.М. Сеченова,
2 Центр по химии лекарственных средств - ВНИХФИ (ген. директор - К.В. Шилин), г. Москва
Проведен обзор чувствительных и специфичных аналитических методов, применяемых при изучении фармакокинетики лекарственных препаратов. Показаны достоинства и ограничения применения имму-ноферментного анализа, метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентной и масс-спектрометрической детекцией. Применение того или иного метода при оценке фармакокинетики лекарственных препаратов в каждом конкретном случае определяется структурой исследуемого соединения и оснащенностью лаборатории.
Ключевые слова: жидкостная хроматография, флюоресцентная и масс-спектрометрическая детекция, иммуноферментный анализ, фармакокинетика.
Изучение фармакокинетики основано главным образом на оценке концентрации в организме пациента лекарственного вещества (ЛВ) в определенные моменты времени после приема препарата. Объектом исследования служат кровь (цельная, сыворотка, плазма), моча, слюна, кал, желчь, амниотическая жидкость и др. Наиболее доступны и чаще исследуются образцы крови и мочи.
Измерение концентрации ЛВ можно разделить на два этапа: 1 - выделение конкретного лекарственного вещества из биологического объекта, концентрирование исследуемого соединения, отделение его от основных эндогенных компонентов; 2 - разделение смеси соединений, идентификация ЛВ и количественный анализ.
Изучение концентрации препарата в крови дает информацию о продолжительности циркуляции лекарства в организме, биодоступности препарата, влиянии концентрации на фармакологический эффект, терапевтической и летальной дозах, динамике образования активных или токсичных метаболитов.
Изучение концентрации препарата в моче позволяет оценить скорость элиминации ЛВ и функцию почек. Концентрация метаболитов в моче - косвенный показатель активности метаболизирующих ферментов.
Исследование биологического материала включает измерение массы (объема) пробы, высвобождение препарата (метаболитов) из 532
клеток пробы, отделение целых клеток (например, при анализе крови) или частей клеток (при анализе гомогенатов тканей), добавление внутреннего стандарта, отделение белков, очистку пробы (центрифугирование, фильтрация), процедуры экстракции, реэкстракции, концентрирования и превращения исследуемых веществ в удобные для анализа производные, основные процедуры обработки проб крови и мочи соответственно (рис. 1).
«Идеальный» аналитический метод измерения концентрации ЛВ должен обладать высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью, возможностью работы с малыми объемами, простотой подготовки материала, дешевизной и легкостью обслуживания оборудования, надежностью и возможностью автоматизации, простотой работы персонала и универсальностью (возможность анализа различных классов ЛВ).
Для получения достоверных данных необходимо делать поправку на стабильность действующего вещества и/или продукта (продуктов), а также степень его биотрансформации в анализируемых биологических средах .
Валидация метода должна проводиться c учетом его предполагаемого применения, при калибровке следует учитывать диапазон концентраций исследуемого образца. Категорически не рекомендуется применять два или более метода анализа проб в одном и том же материале со сходным диапазоном калибровочных значений.
Существует большое число методов определения концентрации ЛВ в биологических жидкостях: xроматографические, микробиологические, спектрофотометрические, полярографические, иммунологические (радиоим-мунные, иммуноэнзимные), радиоизотопные и другие методы.
Критическими параметрами метода являются чувствительность, скорость, точность, возможность работы с малым объемом биоматериала и стоимость.
В табл. 1 сравниваются аналитические методы анализа ЛВ .
Наиболее широко (до 95% исследований) на практике применяется метод высокоэффектив-
Рис. 1. Основные процедуры обработки проб крови и мочи.
ной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с различными видами детекции.
Преимуществами ВЭЖХ по сравнению, например, с методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) являются отсутствие ограничений по термостабильности анализируемых препаратов, возможность работы с водными растворами и летучими соединениями, использования вариантов «нормальнофазной» и «обращеннофазной» хроматографии. Многие из видов детекции являются неразрушающи-
иммуноферментный, ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией, ВЭЖХ с масс-спектрометрической детекцией, которые в настоящее время активно применяются в фармакокинетических исследованиях.
Иммуноферментный метод
Метод иммуноферментного анализа (ИФА) предложен в начале 70-х годов прошлого столетия. Принцип ИФА заключается во взаимодействии специфических белковых ан-
Сравнительная характеристика методов анализа лекарственных средств
Методы Абсолютная чувствительность, г Чувст- витель- ность, баллы Слож- ность, баллы Избира- тельность, баллы Универ- сальность Сум- марная оценка, баллы
Жидкостная хроматография:
УФ-детектор 10-7 3 -3 4 4 8
флуоресцентный детектор 10-8 - 10-9 4 -3 5 2 8
масс-спектрометрический детектор 10-11 - 10-12 5 -5 5 4 9
Иммунологические 10-10 - 10-11 5 -1 4 1 9
Газовая хроматография:
электронозахватный детектор 10-10 5 -4 4 2 7
пламенно-ионизационный детектор 10-8 - 10-9 4 -3 2 4 7
ми; методы детекции, используемые в ВЭЖХ, обладают более высокой специфичностью.
Рассмотрим особенности высокочувствительных методов, позволяющих анализировать нанограммовые количества ЛВ (табл.1):
тител с анализируемым веществом, выступающим в роли антигена. Чем выше концентрация вещества-антигена, тем больше образуется комплексов антиген-антитело. Для количественного анализа комплексообразования при-
меняют два подхода - с предварительным отделением комплекса (гетерогенные методы) или без его отделения (гомогенные методы). В том и другом случае пробу с неизвестной концентрацией анализируемого вещества добавляют к сыворотке, в которой антитело связано в комплекс с меченным аналогом исследуемого вещества, и вещество из анализируемой пробы вытесняется из комплекса. Количество вытесненного меченного аналога пропорционально концентрации вещества в пробе. Определив, сколько меченного аналога оказалось вытеснено из комплекса (или, напротив, осталось связанным), можно рассчитать искомый уровень вещества в пробе. Предварительно проводится калибровка с использованием стандартных растворов (со стандартными концентрациями тестируемого вещества).
Выпускаются наборы реактивов - так называемые диагностикумы (антисыворотка, соединенный с препаратом фермент, субстрат, кофактор, стандартные растворы для калибровки), рассчитанные на 50-200 анализов. Для анализа обычно достаточно 0,05-0,2 мл сыворотки крови больного.
Иммуноэнзимные методы обладают высокой чувствительностью и специфичностью. Диагностикумы сравнительно дешевые и имеют более продолжительные сроки годности, чем наборы для радиоиммунных методов. При использовании ИФА устраняется необходимость отделения комплекса антиген-антитело - достаточно сложной процедуры, с относительно высоким риском ошибки. Им-муноэнзимный метод может выполняться в любой больничной или поликлинической лаборатории; разработаны приборы, обеспечивающие полную автоматизацию анализа.
Простота анализа, высокая чувствительность, точность, воспроизводимость,
умеренная цена аппаратуры и реактивов - все это создает перспективу для широкого внедрения иммунологических методов в медицинскую практику.
Высокоэффективная жидкостная хромотография с флуоресцентной детекцией
При ВЭЖХ детектор генерирует электрический сигнал, сила которого пропорциональна концентрации анализируемого вещества, растворенного в подвижной фазе. В первых жидкостных хроматографах (ионообменных) прошедшая через колонку подвижная фаза с компонентами пробы собиралась в небольшие сосуды, а затем при помощи титрометрии, колориметрии, полярографии и т.д. определялось содержание компонента в этой порции. Иными словами, процессы разделения пробы
и определения ее количественного состава были разделены во времени и пространстве. В современном жидкостном хроматографе эти процессы обеспечиваются одним прибором.
Для детекции компонентов пробы может быть использовано любое физико-химическое свойство подвижной фазы (поглощение или излучение света, электропроводность, показатель преломления и т.д.), которое изменяется при наличии в ней молекул разделяемых соединений. Из существующих 50 физико-химических методов детекции в настоящее время активно используется 5-6.
Чувствительность-важнейшая характеристика детектора. Если определять чувствительность через двойную амплитуду шума нулевой линии, а шум выражать в физических единицах, то чувствительность фотометрического детектора будет выражаться в единицах оптической плотности, рефрактометрического - в единицах показателя преломления, вольтам-перометрического - в амперах, кондуктомет-рического - в сименсах. В фармацевтическом анализе чувствительность выражают в минимальном количестве определяемого вещества. Степень чувствительности различных типов детекторов приведена в табл. 1.
Несмотря на то что в настоящее время 80% хроматографов оснащено в базовой комплектации спектрофотометрическими детекторами, всё большее распространение получает флуоресцентная детекция, особенно при определении концентрации соединений, способных «светиться» под действием возбуждающего излучения. Интенсивность люминесценции пропорциональна интенсивности возбуждающего света. Исследование спектров испускания (флуоресценции и фосфоресценции) - более чувствительный и специфичный метод, чем исследование спектров поглощения.
Спектр флуоресценции вещества во многих случаях представляет собой зеркальное отражение полосы поглощения с наименьшей энергией и обычно располагается рядом с этой полосой с её длинноволновой стороны. Данный метод наиболее удобно применять при исследовании лекарственных препаратов, обладающих собственной флуоресценцией (хлорохин, доксорубицин, доксазо-зин, атенолол, индометацин, пропранолол, тетрациклины, хинидин и др.). Некоторые ЛВ можно сравнительно легко превратить во флуоресцирующие соединения (процесс дериватизации), например гидрокортизон (обработка серной кислотой), меперидин (конденсация с формальдегидом), 6-меркап-топурин и метотрексат (окисление перманганатом калия). Другие препараты с активными функциональными группами можно конденсировать с флуоресцирующими реа-
гентами - флуорескамином (хлордеазепок-сид, новокаинамид, сульфаниламиды и др.), 7-нитробензо-2,1,3-оксадиазолом (пропокси-фен и др.) и т.д. Вместе с тем необходимо отметить, что при высокой чувствительности и селективности флуоресцентные методы детектирования ограничены кругом ЛВ, имеющих естественную флуоресценцию, а процесс дериватизации при количественном анализе требует больших затрат.
Высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрической детекцией
Высокочувствительным вариантом современного детектора для ВЭЖХ, применяемого для фармакокинетических исследований, является масс-спектрометрометр. Масс-спектрометрический детектор позволяет значительно сократить время анализа, в частности за счет исключения подготовительной стадии (экстракции). Данный метод дает возможность одновременно идентифицировать несколько веществ, и это исключает ошибки, связанные с наличием неразделяемых компонентов.
Масс-спектрометрия - один из наиболее перспективных методов физико-химического анализа лекарственных средств. Традиционно органическая масс-спектрометрия используется для решения двух основных проблем: идентификации веществ и изучения фрагментации ионизированных молекул в газовой фазе. Соединение масс-спектрометра с жидкостным хроматографом значительно расширило возможности классического метода. С появлением новых методов ионизации, таких как «электроспрей» (ESI - англ. electrospray ionization) - ионизация в электрическом поле при атмосферном давлении) и «МАЛДИ» - ионизация лазерной десорбцией, список молекул, которые могут быть изучены данным методом, значительно расширился.
В настоящее время комбинация ВЭЖХ и масс-спектрометрического детектора с «электроспреем» нашла широкое распространение в исследовании фармакокинетики и биоэквивалентности лекарственных препаратов . Первоначально метод ESI был разработан под руководством Л.Н. Галль , а в 2002 г. Д. Фен-ну и К. Танаке была присуждена Нобелевская премия за разработку методов индентифика-ции и структурного анализа биологических макромолекул и, в частности, методов масс-спектрометрического анализа биологических макромолекул. В механизме образования ионизированных частиц выделяют три стадии. Первая - образование заряженных капель на срезе капилляра. Посредством приложенного напряжения происходит перераспределение заряда в растворе, положительные ионы скап-
ливаются у выхода. При сильном приложенном поле (3-5 кВ) образуется струя из вершины конуса, которая далее разлетается на мелкие капли. Вторая стадия - постепенное сокращение размеров заряженных капель за счет испарения растворителя и последующего распада капель вплоть до получения истинных ионов. Заряженные капли движутся сквозь атмосферу по направлению к противоположному электроду. Третья стадия - повторяющиеся циклы разделения и уменьшения объема капель до полного испарения растворителя и образования ионов в газовой фазе.
Современные ЖХ-МС системы (LC/MS - англ. liquid chromatography/mass-spectrometry) позволяют регистрировать полный ионный ток (TIC - англ. total ion current), проводить контроль заданных ионов (SIM - англ. selected ion monitoring) и контроль заданных реакций селективное мониторирование реакции (SRM - англ. selected reaction monitoring).
При анализе полного ионного тока (TIC) получают данные обо всех соединениях, последовательно выходящих из хроматографической колонки. Масс-хроматограммы напоминают хроматограммы с УФ-детекцией, при этом площадь под пиком соответствует количеству вещества. При определении заданных ионов (SIM) оператор может ограничить диапазон детекции необходимых соединений выделив, например, минорные вещества. Наибольшей чувствительностью и специфичностью обладает SRM-метод, когда регистрация ионного тока идет по одному выбранному иону, характерному для исследуемого соединения (при ESI-ионизации и регистрации положительных ионов это, как правило, - молекулярный ион МН+).
В недавно опубликованных работах обсуждается возможность количественного анализа органических веществ в биологических объектах без хроматографического разделения с помощью мультионной детекции и внутреннего контроля в виде меченного дейтерием аналога . В частности, для молекул липидной природы определен диапазон концентраций (от пико- до наномолей), при котором авторы наблюдали линейную зависимость интенсивности ионного тока от концентрации вещества. Увеличение концентрации соединений в растворе приводило к ион-молекулярным взаимодействиям в процессе ионизации и нарушению линейности.
Описан метод количественного определения простагландинов и полиненасыщен-ных жирных кислот с использованием электроспрей-ионизации - масс-спектрометрии без хроматографического разделения с применением внутреннего стандарта и регистрации отрицательных ионов . В работе
Ю.О. Каратассо и И. В. Логуновой чувствительность масс-спектрометрии при исследовании потенциального антиаритмического средства составила 3 нг/0,5 мл плазмы крови.
При выборе аналитического метода необходимо иметь в виду, что использование ИФА лимитируется наличием обязательных реактивов, флуоресцентной детекции, необходимостью собственной флуоресценции у исследуемого соединения. Хотя при масс-спектрометрической детекции вышеуказанные ограничения несущественны, однако стоимость оборудования на сегодняшний день остается достаточно высокой, и данный вид анализа требует специальных навыков.
ЛИТЕРАТУРА
1. Александров М.Л., Галль Л.Н., Краснов Н.В. и др. Экстракция ионов из растворов при атмосферном давлении - новый метод масс-спектрометрического анализа // Докл. Акад. наук СССР. - 1984. - Т.277. - № 2. -
2. Каратассо Ю.О, Логунова И. В., Сергеева М. Г. и др. Количественный анализ лекарственных препаратов в плазме крови с использованием электроспрей ионизации - масс-спектрометрии без хроматографического разделения // Хим. фарм. журн. - 2007. - № 4. - С. 161-166.
3. Каратассо Ю.О, Алёшин С.Е., Попова Н.В. и др. Количественный анализ простагландинов и полине-насыщенных жирных кислот методом масс-спектро-метрии с ионизацией электрораспылением // Масс-спектрометрия. -2007. - Т.4. - В.3. - С. 173-178.
4. Холодов Л.Е, Яковлев В.П. Клиническая фармакокинетика. - М.:Медицина, 1985. - 463 с.
5. Covey T.R., Lee E.D., Henion J.D. High-speed liquid chromatography/tandem mass spectrometry for the determination of drugs in biological samples // Anal. Chem. - 1986. - Vol. 58 (12). - P. 2453-2460.
6. Conference report on analytical methods validation: bioavailability, bioequivalence and pharmacokinetic studies // J. Pharmac. sci. - 1992. - Vol.81. - P. 309-312.
7. De Long C.J., Baker P.R.S., SamuelM. et al. Molecular species composition of rat liver phospholipids by ESI-MS/ MS: The effect of chromatography//J. Lipid Res. - 2001. - Vol. 42. - P. 1959-1968.
8. Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Ed. R.B.Cole // Wiley. - New York, 1997.
9. Han X., Yang K., Yang J. et al. Factors influencing the electrospray intrasource separation and selective ionization of glycerophospholipids // Am. Soc. Mass Spectrom. - 2006. - Vol. 17(2). - P. 264-274.
10. Koivusalo M., Haimi P., Heikinheimo L. et al. Quantitative determination of phospholipids compositions by ESI-MS: Effects of acyl chain length, unsaturation, and lipid concentration on instrument response // J. Lipid Res. - 2001. - Vol. 42. - P. 663-672.
11. Lee M.S., Kerns E.H. LC/MS applications in drug discovery//Mass Spectrom. Rev. - 1999. - Vol. 18 (3-4). - P. 187-279.
Поступила 28.05.10.
ANALYSIS OF DRUGS IN PHARMACOKINETIC STUDIES
D.V. Reikhart, V.V. Chistyakov
Conducted was a review of sensitive and specific analytical methods for studying the pharmacokinetics of drugs. Shown were the advantages and limitations of immune-enzyme analysis, of high performance liquid chromatography with fluorescence and mass spectrometric detection. The usage of a method in the evaluation of the pharmacokinetics of drugs in each case should be determined by the structure of the compound and the laboratory equipment.
Key words: liquid chromatography, fluorescence and mass spectrometric detection, immune-enzyme analysis, pharmacokinetics.
Биологическую оценку качества лекарственных препаратов обычно проводят по силе фармакологического эффекта или по токсичности. Применяют биологические методы, когда с помощью физических, химических или физико-химических методов не удается сделать заключение о чистоте или токсичности лекарственного препарата или когда способ получения препарата не гарантирует постоянства активности (например, антибиотики).
Проводят биологические испытания на животных (кошки, собаки, кролики, лягушки и др.), отдельных изолированных органах (рог матки, часть кожи), отдельных группах клеток (форменные элементы крови), а также на определенных штаммах микроорганизмов. Активность препаратов выражают в единицах действия (ЕД).
Биологический контроль лекарств, содержащих сердечные гликози- ды. По ГФ XI проводят биологическую оценку активности лекарственного растительного сырья и полученных из него препаратов, содержащих сердечные гликозиды, в частности наперстянки (пурпурной, крупноцветковой и шерстистой), горицвета, ландыша, строфанта, желтушника серого. Испытания проводят на лягушках, кошках и голубях, устанавливая соответственно лягушачьи (ЛЕД), кошачьи (КЕД) и голубиные (ГЕД) единицы действия. Одна ЛЕД соответствует дозе стандартного образца, вызывающего в условиях опыта систолическую остановку сердца у большинства подопытных стандартных лягушек (самцы массой 28--33 г). Одна КЕД или ГЕД соответствует дозе стандартного образца или испытуемого препарата из расчета на 1 кг массы животного или птицы, вызывающего систолическую остановку сердца кошки или голубя. Содержание ЕД рассчитывают в 1,0 г исследуемого лекарственного средства, если испытывают растительное сырье или сухие концентраты; в одной таблетке или в 1 мл, если испытывают жидкие лекарственные формы.
Испытание на токсичность. В этот раздел ГФ XI, вып. 2 (с. 182) по сравнению с ГФ X внесен ряд дополнений и изменений, отражающих возрастающие требования к качеству лекарственных средств и необходимость унификации условий их испытаний. В статью введен раздел, в котором описан порядок отбора проб. Увеличена масса животных, на которых проводят испытание, указаны условия их содержания и срок наблюдения за ними. Для выполнения испытания отбирают по два флакона или ампулы от каждой серии, содержащей не более 10000 флаконов или ампул. Из партий с большим количеством отбирают по три ампулы (флакона) от каждой серии. Содержимое проб одной серии смешивают и испытывают на здоровых белых мышах обоего пола массой 19--21 г. Испытуемый раствор вводят в хвостовую вену пяти мышей и ведут наблюдение за животными 48 ч. Препарат считается выдержавшим испытание, если ни одна из подопытных мышей не погибнет в течение указанного срока. В случае гибели даже одной мыши испытание повторяют по определенной схеме. В частных статьях может быть указан и другой порядок проведения испытания на токсичность.
Испытания на пирогенность. Бактериальные пирогены представляют собой вещества микробного происхождения, способные вызвать у человека и теплокровных животных при попадании в кровяное русло повышение температуры тела, лейкопению, падение кровяного давления и другие изменения в различных органах и системах организма. Пирогенную реакцию вызывают грамотрицательные живые и мертвые микроорганизмы, а также продукты их распада. Допустимо содержание, например, в изотоническом растворе натрия хлорида 10 микроорганизмов в 1 мл, а при введении не более 100 мл допускается 100 на 1 мл. Испытанию на пирогенность подвергают воду для инъекций, инъекционные растворы, иммунобиологические лекарственные средства, растворители, используемые для приготовления инъекционных растворов, а также лекарственные формы, вызывающие, по сведениям клиник, пирогенную реакцию.
В ГФ XI, как и в фармакопеи других стран мира, включен биологический метод испытания пирогенности, основанный на измерении температуры тела кроликов после введения в ушную вену испытуемых стерильных жидкостей. Отбор проб проводится так же, как при испытании на токсичность. В общей статье (ГФ XI, вып. 2, с. 183--185) указаны требования к подопытным животным и порядок их подготовки к проведению испытаний. Испытуемый раствор проверяют на трех кроликах (не альбиносах), масса тела которых отличается не более чем на 0,5 кг. Температуру тела измеряют, вводя термометр в прямую кишку на глубину 5--7 см. Испытуемые жидкости считают непирогенными, если сумма повышенной температуры у трех кроликов равна или меньше 1,4°С. Если эта сумма превышает 2,2°С, то воду для инъекций или инъекционный раствор считают пирогенными. Если сумма повышения температуры у трех кроликов находится в пределах от 1,5 до 2,2° С, испытание повторяют дополнительно на пяти кроликах. Испытуемые жидкости считают непирогенными, если сумма повышений температуры у всех восьми кроликов не превышает 3,7°С. В частных ФС могут быть указаны другие пределы отклонений температуры. Кроликов, бывших в опыте, можно использовать для этой цели повторно не ранее чем через 3 сут., если введенный им раствор был непирогенным. Если же введенный раствор оказался пирогенным, то кроликов повторно можно использовать только через 2--3 недели. В ГФ XI по сравнению с ГФ X введена проверка на реактивность кроликов, впервые используемых для испытаний, и уточнен раздел о возможности их использования для повторных испытаний.
Рекомендуемый ГФ XI биологический метод отличается специфичностью, но не дает количественной оценки содержания пирогенных веществ. К существенным его недостаткам следует отнести трудоемкость и продолжительность испытаний, необходимость содержания животных, ухода за ними, сложность подготовки к проведению испытаний, зависимость результатов от индивидуальных особенностей каждого животного и т.д. Поэтому предпринимались попытки разработки других методов определения пирогенности.
Наряду с определением пирогенности на кроликах за рубежом используют микробиологический метод, основанный на подсчете общего числа микроорганизмов в исследуемой лекарственной форме до ее стерилизации. В нашей стране предложена простая и доступная методика обнаружения пирогенов, основанная На избирательной идентификации грамотрицательных микроорганизмов по реакции образования геля с применением 3%-ного раствора гидроксида калия. Методика может быть использована на химико-фармацевтических предприятиях.
Предпринята попытка заменить биологический метод определения пирогенности химическим. Растворы, содержащие пирогены, после обработки хиноном показывали отрицательную реакцию с тетрабромфенолфталеином. Пирогенал с триптофаном в присутствии серной кислоты образует буро-малиновое окрашивание при содержании пирогенала 1 мкг и более.
Исследовалась возможность спектрофотометрического определения пирогенных веществ в УФ-области спектра. Растворы фильтрата пирогенсодержащих культур микроорганизмов обнаруживают слабовыраженный максимум поглощения при 260 нм. По чувствительности спектрофотометрический метод определения пирогенов в 7-8 раз уступает биологическому испытанию на кроликах. Однако если перед спектрофотометрированием провести ультрафильтрование, то вследствие концентрирования пирогенов можно достигнуть сопоставимых результатов определения биологическим и спектрофотометрическим методами.
После обработки хиноном растворы пирогенов приобретают красную окраску и появляется максимум светопоглощения при 390 нм. Это позволило разработать фотоколориметрический способ определения пирогенов.
Высокая чувствительность люминесцентного метода создала предпосылки использования его для определения пирогенных веществ в концентрации до 1*10 -11 г/мл. Разработаны методики люминесцентного обнаружения пирогенов в воде для инъекций и в некоторых инъекционных растворах с применением красителей родамина 6Ж и 1-анилино-нафталин-8-сульфоната. Методики основаны на способности пирогенов увеличивать интенсивность люминесценции указанных красителей. Они позволяют получать результаты, сопоставимые с биологическим методом.
Относительная ошибка спектрофотометрического и люминесцентного определения не превышает ±3%. Для определения пирогенности воды для инъекций используют также хемилюминесцентный метод.
Перспективным методом является полярография. Установлено, что фильтраты пирогенных культур даже в очень разбавленном состоянии оказывают сильное подавляющее действие на полярографический максимум кислорода. На этой основе разработан способ полярографической оценки качества воды для инъекций и некоторых инъекционных растворов.
Испытание на содержание веществ гистаминоподобного действия.
Данному испытанию подвергают парентеральные лекарственные средства. Выполняют его на кошках обоего пола массой не менее 2 кг под уретановым наркозом. Вначале животному, находящемуся под наркозом, вводят гистамин, проверяя его чувствительность к этому веществу. Затем с интервалом 5 мин продолжают повторные введения (0,1 мкг/кг) стандартного раствора гистамина до тех пор, пока при двух последовательных введениях не будет получено одинаковое снижение артериального давления, которое принимается за стандартное. После этого с интервалом 5 мин животному вводят испытуемый раствор с той же скоростью, с которой вводили гистамин. Препарат считают выдержавшим испытание, если снижение артериального давления после введения тест-дозы не превышает реакции на введение 0,1 мкг/кг в стандартном растворе.
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ
ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «СИБИРСКИЙ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РФ
Анализ сложных лекарственных форм
Ч. 1. Лекарственные формы аптечного производства
Учебное пособие
Для самостоятельной подготовки и руководство к лабораторным занятиям по фармацевтической химии для студентов фармацевтических факультетов вузов очной и заочной формы обучения
УДК 615.07 (071) ББК Р 282 Е 732
Е.В. Ермилова, В.В. Дудко, Т.В. Кадырова Анализ сложных лекарственных форм Ч. 1. Лекарственные формы аптечного производства: Уч. пособие. – Томск: Изд. 20012 . – 169 с.
Пособие содержит методики анализа лекарственных форм аптечного производства. В нем рассмотрены терминологии, классификации лекарственных форм, приведены нормативные документы, контролирующие качество лекарственных средств аптечного производства, указаны особенности внутриаптечного экспресс-анализа; подробно излагаются основные этапы анализа лекарственных форм, при этом, особое внимание уделяется химическому контролю.
Основная часть пособия посвящена изложению материала по анализу лекарственных форм: жидких (микстуры, стерильные) и твердых (порошки), приведены многочисленные примеры.
В приложение вынесены выписки из приказов, рефрактометрические таблицы, информация по индикаторам, формы отчетных журналов.
Для студентов фармацевтических факультетов высших учебных заведений.
Табл. 21. Илл. 27. Библиогр.: 18 назв.
Предисловие . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
I. ВВЕДЕНИЕ В АНАЛИЗ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ
1.1. Термины, применяемые в фармации. . . . . . . . . . . . . . . . ………. 5 1.1.1. Термины, характеризующие лекарственные средства.. ….5 1.1.2. Термины, характеризующие лекарственные формы. . . ….5 1.2. Классификация лекарственных форм. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.3. Нормативные документы и требования к качеству лекарственных средств аптечного производства. . . . . . . . . . . . . …...7 1.4. Особенности экспресс-анализа лекарственных средств аптечного производства. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……………8
1.4.1. Особенности определения подлинности экспресс-методом. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ………..9
1.4.2. Особенности количественного экспресс-анализа. . . . . . . . …9
2.1. Органолептический и физический контроль. . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 2.1.1. Органолептический контроль. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 2.1.2. Физический контроль. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 2.2.Химический контроль. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11 2.2.1.Испытания на подлинность. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11 2.2.2.. Количественный анализ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . 14
2.2.2.1. Способы выражения концентраций. . . . . . . . . . . . . . . . .15 2.2.2.2. Методы титриметрического анализа. . . . . . . . . . . . . . . 16 2.2.2.3. Расчет массы (объема) лекарственной формы и объема титранта для анализа. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.2.2.4. Обработка результатов измерений. . . . . . . . . . . . . . . . . .19 2.2.2.5. Оформление результатов анализа. . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
III. АНАЛИЗ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ
Жидкие лекарственные формы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33
3.1. Анализ микстур. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33 3.2. Анализ стерильных лекарственных форм. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
Твердые лекарственные формы
3.3. Порошки. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .89
Вопросы контроля самоподготовки. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
Тестовый контроль. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .125
Ответы тестового контроля. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .130
ПРИЛОЖЕНИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .131
Список литературы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .168
Предисловие
Основой для написания учебного пособия явилась программа по фармацевтической химии для студентов фармацевтических вузов (факультетов)
М.: ГОУ ВУНМЦ, 2003 г.
Одной из составных частей фармацевтического анализа является анализ лекарственных средств аптечного и заводского производства, осуществляемый методами фармакопейного анализа, по требованиям различных указаний,
пособий, инструкций и т. п.
Учебное пособие посвящено методам исследования лекарственных форм
(микстуры, стерильные, порошки), изготавливаемых в аптеке, где используются все виды внутриаптечного контроля, но самым действенным является химический контроль, который дает возможность проверить соответствие изготовленной лекарственной формы рецептурной прописи, как по подлинности, так и по количественному содержанию. Приведенные методики определения подлинности и количественного содержания составлены таким образом, чтобы использовать оптимальные методы исследования, и на анализ затрачивалось минимальное количество лекарственного средства.
В основной части приведены многочисленные примеры использования рефрактометрии в количественном анализе лекарственных средств, так как этот метод широко используется в аптечной практике.
Предложенное учебное пособие способствует развитию у студентов химического аналитического мышления.
I. ВВЕДЕНИЕ В АНАЛИЗ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ
1.1. Термины, применяемые в фармации
1.1.1. Термины, характеризующие лекарственные средства
Лекарственные средства – вещества, применяемые для профилактики,
диагностики, лечения болезни, предотвращения беременности, полученные из
биологических технологий.
Лекарственное вещество - лекарственное средство, представляющее собой индивидуальное химическое соединение или биологическое вещество.
Лекарственный препарат - лекарственное средство в виде определенной
лекарственной формы.
Лекарственная форма - придаваемое лекарственному средству или лекарственному растительному сырью удобное для применения состояние, при котором достигается необходимый лечебный эффект.
1.1.2. Термины, характеризующие лекарственные формы
Порошки твердая лекарственная форма для внутреннего и наружного применения, состоящая из одного или нескольких измельченных веществ и обладающая свойством сыпучести.
Таблетки – дозированная лекарственная форма, получаемая прессованием лекарственных или смеси лекарственных и вспомогательных веществ, предназначенная для внутреннего, наружного, сублингвального,
имплантационного или парентерального применения.
Капсулы – дозированная лекарственная форма, состоящая из лекарственного средства, заключенного в оболочку.
Мази мягкая лекарственная форма, предназначенная для нанесения на кожу, раны или слизистые оболочки и состоящая из лекарственного вещества и основы.
Пасты - мази с содержанием порошкообразных веществ свыше 20-25%.
Суппозитории дозированная лекарственная форма, твердая при комнатной температуре и расплавляющаяся при температуре тела.
Растворы жидкая лекарственная форма, полученная путем растворения одного или нескольких лекарственных веществ, предназначенных для инъекционного, внутреннего или наружного применения.
Капли жидкая лекарственная форма, предназначенная для внутреннего или наружного применения, дозируемая каплями.
Суспензии жидкая лекарственная форма, содержащая в качестве дисперсной фазы одно или несколько измельченных порошкообразных лекарственных веществ, распределенных в жидкой дисперсионной среде.
Эмульсии однородная по внешнему виду лекарственная форма,
состоящая из взаимно нерастворимых тонко диспергированных жидкостей,
предназначенная для внутреннего, наружного или парентерального применения.
Экстракты – концентрированные извлечения из лекарственного растительного сырья. Различают жидкие экстракты (Extracta fluida); густые экстракты (Extracta spissa) – вязкие массы с содержанием влаги не более 25%;
сухие экстракты (Extracta sicca) – сыпучие массы с содержанием влаги не более
Настои лекарственная форма, представляющая собой водное извлечение из лекарственного растительного сырья или водный раствор сухих или жидких экстрактов (концентратов).
Отвары настои, отличающиеся режимом экстракции.
Аэрозоли лекарственная форма, в которой лекарственные и вспомогательные вещества находятся под давлением газа-вытеснителя
(пропеллента) в аэрозольном баллоне, герметически закрытом клапаном.
1.2. Классификация лекарственных форм
Классификацию лекарственных форм проводят в зависимости от:
1.2.1. Агрегатного состояния Твердые: порошки, таблетки, драже, гранулы и др.
Жидкие : истинные и коллоидные растворы, капли, суспензии, эмульсии,
линименты, и др.
Мягкие : мази, суппозитории, пилюли, капсулы и др.
Газообразные : аэрозоли, газы.
1.2.2. Количества лекарственных веществ
Однокомпонентные
Многокомпонентные
1.2.3. Места изготовления
Заводского
Аптечного
1.2.4. Способа изготовления
Растворы для инъекций Микстуры Глазные капли Отвары Настои Аэрозоли Настои
Гомеопатические средства и т. д.
1.3. Нормативные документы и требования к качеству
лекарственных средств аптечного производства
Вся производственная деятельность аптеки должна быть направлена на обеспечение высококачественного изготовления лекарственных средств.
Одним из важнейших факторов, определяющих качество лекарственных средств, изготовляемых в аптеке, является организация внутриаптечного контроля.
Внутриаптечный контроль – это комплекс мероприятий, направленных на своевременное выявление и предупреждение ошибок, возникающих в процессе изготовления, оформления и отпуска лекарств.
Лекарства аптечного производства подвергаются нескольким видам контроля в зависимости от характера лекарственной формы.
Система внутриаптечного контроля качества лекарственных средств предусматривает проведение предупредительных мероприятий, приемочного, органолептического, письменного, опросного, физического, химического контроля и контроля при отпуске.
Согласно инструкции Министерства здравоохранения Российской Федерации «О контроле качества лекарственных средств, изготовляемых в аптеках» (Приказ № 214 от 16 июля 1997 г.), все лекарственные средства подвергаются внутриаптечному контролю: органолептическому, письменному и контролю при отпуске – обязательно, опросному и физическому – выборочно, а химическому – в соответствии с пунктом 8 данного приказа (смотри приложение).
1.4. Особенности экспресс-анализа лекарственных средств
аптечного производства
Необходимость внутриаптечного контроля обусловлена соответствующими высокими требованиями к качеству лекарственных средств, изготовляемых в аптеках.
Поскольку изготовление и отпуск лекарственных препаратов в аптеках ограничивается сжатыми сроками, оценку их качества осуществляют экспресс– методами.
Основные требования, предъявляемые к экспресс-анализу, расход минимальных количеств лекарственных средств при достаточной точности и чувствительности, простота и быстрота выполнения по возможности без разделения ингредиентов, возможность проведения анализа без изъятия приготовленного лекарственного препарата.
Если не удается выполнить анализ без разделения компонентов, то используют те же принципы разделения, что и при макро-анализе.
1.4.1. Особенности определения подлинности экспресс – методом
Основное отличие определения подлинности экспресс - методом от макро-анализа заключается в использовании малых количеств исследуемых смесей без их разделения.
Анализ выполняют капельным методом в микро-пробирках, фарфоровых чашках, на часовых стеклах, при этом расходуется от 0,001 до 0,01 г порошка или 1 5 капель исследуемой жидкости.
Для упрощения анализа достаточно проведение одной реакции для вещества, причем наиболее простой, например, для атропина сульфата достаточно подтвердить наличие сульфат-иона, для папаверина гидрохлорида – хлорид - иона классическими методами.
1.4.2. Особенности количественного экспресс-анализа
Количественный анализ может быть выполнен титриметрическими или физико-химическими методами.
Титриметрический экспресс-анализ отличается от макро - методов расходом меньших количеств анализируемых препаратов: 0,05 0,1 г порошка или 0,5 2 мл раствора, причем точную массу порошка можно отвешивать на ручных весах; для повышения точности можно использовать разбавленные растворы титрантов: 0,01 0,02 моль/л.
Навеску порошка или объем жидкой лекарственной формы берут с таким расчетом, чтобы на определение расходовалось 1 3 мл раствора титранта.
Из физико-химических методов в аптечной практике широко используется экономичный метод рефрактометрии при анализе концентратов,
полуфабрикатов и других лекарственных форм.
II. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
2.1. Органолептический и физический контроль
2.1.1. Органолептический контроль
Органолептический контроль заключается в проверке лекарственной формы по следующим показателям: внешний вид («Описание»), запах,
однородность, отсутствие механических примесей. На вкус проверяются выборочно, а лекарственные формы, приготовленные для детей – все.
Однородность порошков, гомеопатических тритураций, мазей, пилюль,
суппозиториев проверяется до разделения массы на дозы в соответствии с требованиями действующей Государственной фармакопеи. Проверка осуществляется выборочно у каждого фармацевта в течение рабочего дня с учетом видов лекарственных форм. Результаты органолептического контроля регистрируются в журнале.
2.1.2. Физический контроль
Физический контроль заключается в проверке общей массы или объема лекарственной формы, количества и массы отдельных доз (не менее трех доз),
входящих в данную лекарственную форму.
При этом проверяются:
Каждая серия фасовки или внутриаптечной заготовки в количестве не менее трех упаковок;
Лекарственные формы, изготовленные по индивидуальным рецептам (требованиям), выборочно в течение рабочего дня с учетом всех видов лекарственных форм, но не менее 3% от количества лекарственных форм, изготовленных за день;
4.2 Оптические методы
К этой группе относятся методы, основанные на определении показателя преломления луча света в растворе испытуемого вещества (рефрактометрия), измерении интерференции света (интерферометрия), способности раствора вещества вращать плоскость поляризованного луча (поляриметрия).
Оптические методы находят все более широкое применение в практике внутриаптечного контроля ввиду экспрессности, минимального расхода анализируемых лекарств.
Рефрактометрия использована для испытания подлинности лекарственных веществ, представляющих собой жидкости (диэтиламид никотиновой кислоты, метилсалицилат, токоферола ацетат), а во внутриаптечном контроле -- для анализа лекарственных форм, в том числе двойных и тройных смесей. Применяют также объемно-рефрактометрический анализ и рефрактометрический анализ методом полной и неполной экстракции.
Разработаны различные варианты методик анализа интерферометрическим методом лекарственных препаратов, титрованных растворов, дистиллированной воды.
Поляриметрию применяют для испытания подлинности лекарственных веществ, в молекулах которых имеется асимметрический атом углерода. Среди них большинство препаратов из групп алкалоидов, гормонов, витаминов, антибиотиков, терпенов.
В аналитической химии и фармацевтическом анализе используются рентгенорефрактометрия порошков, спектрополяриметрический анализ, лазерная интерферометрия, дисперсия вращения и круговой дихроизм.
Помимо указанных оптических методов для идентификации индивидуальных лекарственных веществ в фармацевтическом и токсикологическом анализе не теряет своего значения химическая микроскопия. Перспективно применение электронной микроскопии, особенно в фитохимическом анализе. В отличие от оптической микроскопии объект подвергается воздействию пучка электронов высоких энергий. Изображение, образованное рассеянными электронами, наблюдают на флуоресцирующем экране.
Одним из перспективных экспрессных физических методов является рентгенографический анализ. Он позволяет идентифицировать лекарственные вещества в кристаллической форме и различать при этом их полиморфное состояние. Для анализа кристаллических лекарственных веществ могут быть также применены различные виды микроскопии и такие методы, как оже-спектрометрия, фотоакустическая спектроскопия, компьютерная томография, измерения радиоактивности и др.
Эффективным недеструктивным методом является отражательная инфракрасная спектроскопия, которая используется для определения примесей различных продуктов разложения и воды, а также в анализе многокомпонентных смесей.
4.3 Абсорбционные методы
Абсорбционные методы основаны на свойствах веществ поглощать свет в различных областях спектра.
Атомно-абсорбционная спектрофотометрия основана на использовании ультрафиолетового или видимого излучения резонансной частоты. Поглощение излучения вызывается переходом электронов с внешних орбиталей атомов на орбитали с более высокой энергией. Объектами, поглощающими излучение, являются газообразные атомы, а также некоторые органические вещества. Сущность определений методом атомно-абсорбционной спектрометрии состоит в том, что через пламя, в котором распыляется анализируемый раствор пробы, проходит резонансное излучение от лампы с полым катодом. Это излучение попадает на входную щель монохроматора, причем из спектра выделяется только резонансная линия испытуемого элемента. Фотоэлектрическим методом измеряют уменьшение интенсивности резонансной линии, происходящей вследствие поглощения ее атомами определяемого элемента. Расчет концентрации производят с помощью уравнения, отражающего ее зависимость от ослабления интенсивности излучения источника света, длины поглощающего слоя и коэффициента поглощения света в центре линии поглощения. Метод отличается высокой избирательностью и чувствительностью.
Поглощение резонансных линий измеряют на атомно-абсорбцион- ных спектрофотометрах типа "Спектр-1", "Сатурн" и др. Точность определений не превышает 4%, предел обнаружения достигает 0,001 мкг/мл. Это свидетельствует о высокой чувствительности метода. Он находит все более широкое применение для оценки чистоты лекарственных препаратов, в частности определения минимальных примесей тяжелых металлов. Перспективно использование атомно-абсорбционной спектрофотометрии для анализа поливитаминных препаратов, аминокислот, барбитуратов, некоторых антибиотиков, алкалоидов, галогенсодержащих лекарственных веществ, ртутьсодержащих соединений.
Возможно также применение в фармации рентгеновской абсорбционной спектроскопии, основанной на поглощении атомами рентгеновского излучения.
Ультрафиолетовая спектрофотометрия -- наиболее простой и широко применяемый в фармации абсорбционный метод анализа. Его используют на всех этапах фармацевтического анализа лекарственных препаратов (испытания подлинности, чистоты, количественное определение). Разработано большое число способов качественного и количественного анализа лекарственных форм методом ультрафиолетовой спектрофотометрии. Для идентификации могут быть использованы атласы спектров лекарственных веществ, систематизирующие сведения о характере спектральных кривых и значениях удельных показателей поглощения.
Известны различные варианты использования метода УФ-спектрофотометрии для идентификации. При испытаниях на подлинность идентифицируют лекарственные вещества по положению максимума светопоглощения. Чаще в фармакопейных статьях приведены положения максимума (или минимума) и соответствующие им значения оптических плотностей. Иногда используют метод, основанный на вычислении отношения оптических плотностей при двух длинах волн (они обычно соответствуют двум максимумам или максимуму и минимуму светопоглощения). Идентифицируют целый ряд лекарственных веществ также по удельному показателю поглощения раствора.
Весьма перспективно для идентификации лекарственных веществ использование таких оптических характеристик, как положение полосы поглощения в шкале длин волн, частота в максимуме поглощения, значение пиковой и интегральной интенсивности, полуширина и асимметрия полос, сила осциллятора. Эти параметры делают более надежной идентификацию веществ, чем установление длины волны максимума светопоглощения и удельного показателя поглощения. Эти константы, позволяющие охарактеризовать наличие связи между УФ-спектром и структурой молекулы, были установлены и использованы для оценки качества лекарственных веществ, содержащих гетероатом кислорода в молекуле (В.П.Буряк).
Объективный выбор оптимальных условий количественного спектрофотометрического анализа можно осуществить только предварительным исследованием констант ионизации, влияния природы растворителей, рН среды и других факторов на характер спектра поглощения.
В НТД приведены различные способы использования УФ-спектрофотометрии для количественного определения лекарственных веществ, являющихся витаминами (ретинола ацетат, рутин, цианокобаламин), стероидными гормонами (кортизона ацетат, преднизон, прегнин, тестостерона пропионат), антибиотиками (натриевые соли оксациллина и метициллина, феноксиметилпенциллин, левомицетина стеарат, гризеофульвин). В качестве растворителей для спектрофотометрических измерений обычно используют воду или этанол. Расчет концентрации проводят различными способами: по стандарту, удельному показателю поглощения или калибровочному графику.
Количественный спектрофотометрический анализ целесообразно комбинировать с установлением подлинности по УФ-спектру. В этом случае раствор, приготовленный из одной навески, можно использовать для обоих этих испытаний. Чаще всего при спектрофотометрических определениях применяют способ, основанный на сравнении оптических плотностей анализируемого и стандартного растворов. Определенных условий анализа требуют лекарственные вещества, способные образовывать кислотно-основные формы в зависимости от рН среды. В таких случаях необходимо предварительно подбирать условия, в которых вещество в растворе полностью будет находиться в одной из таких форм.
Для уменьшения относительной погрешности фотометрического анализа, в частности снижения систематической ошибки, весьма перспективно использование стандартных образцов лекарственных веществ. Учитывая сложность получения и высокую стоимость, они могут быть заменены эталонами, приготавливаемыми из доступных неорганических соединений (дихромата калия, хромата калия).
В ГФ XI расширена область применения УФ-спектрофотометрии. Метод рекомендован для анализа многокомпонентных систем, а также для анализа лекарственных веществ, которые сами не поглощают свет в ультрафиолетовой и видимой областях спектра, но могут быть превращены в поглощающие свет соединения с помощью различных химических реакций.
Дифференциальные методы позволяют расширить область применения фотометрии в фармацевтическом анализе. Они дают возможность повысить ее объективность и точность, а также анализировать высокие концентрации веществ. Кроме того, этими методами можно анализировать многокомпонентные смеси без предварительного разделения.
Метод дифференциальной спектрофотометрии и фотоколориметрии включен в ГФ XI, вып. 1 (с. 40). Сущность его заключается в измерении светопоглощения анализируемого раствора относительно раствора сравнения, содержащего определенное количество испытуемого вещества. Это приводит к изменению рабочей области шкалы прибора и снижению относительной погрешности анализа до 0,5--1%, т.е. такой же, как и у титриметрических методов. Хорошие результаты были получены при использовании вместо растворов сравнения нейтральных светофильтров с известной оптической плотностью; входящих в комплект спектрофотометров и фотоколориметров (В.Г.Беликов).
Дифференциальный метод нашел применение не только в спектрофотометрии и фотоколориметрии, но и в фототурбидиметрии, фотонефелометрии, интерферометрии. Дифференциальные методы могут быть распространены и на другие физико-химические методы. Большие перспективы для анализа лекарств имеют и методы химического дифференциального анализа, основанные на использовании таких химических воздействий на состояние лекарственного вещества в растворе, как изменение рН среды, смена растворителя, изменение температуры, влияние электрических, магнитных, ультразвуковых полей и др.
Широкие возможности открывает в количественном спектрофотометрическом анализе один из вариантов дифференциальной спектрофотометрии -- ?Е-метод. Он основан на превращении анализируемого вещества в таутомерную (или иную) форму, отличающуюся по характеру светопоглощения.
Новые возможности в области идентификации и количественного определения органических веществ открывает использование производной УФ-спектрофотометрии. Метод основан на выделении индивидуальных полос из УФ-спектров, представляющих собой сумму налагающихся полос поглощения или полос, не имеющих четко выраженного максимума поглощения.
Производная спектрофотометрия дает возможность идентификации сходных по химической структуре лекарственных веществ или их смесей. Для повышения избирательности качественного спектрофотометрического анализа применяют способ построения вторых производных УФ-спектров. Вторую производную можно рассчитать способом численного дифференцирования.
Разработан унифицированный метод получения производных от спектров поглощения, который учитывает особенности характера спектра. Показано, что вторая производная имеет разрешающую способность примерно в 1,3 раза больше по сравнению с непосредственной спектрофотометрией. Это позволило использовать данный метод для идентификации кофеина, теобромина, теофиллина, папаверина гидрохлорида и дибазола в лекарственных формах. Вторая и четвертая производные в количественном анализе более эффективны по сравнению с титриметрическими методами. Продолжительность определения сокращается в 3-4 раза. Определение указанных препаратов в смесях оказалось возможным вне зависимости от характера поглощения сопутствующих веществ или при существенном уменьшении влияния их светопоглощения. Это позволяет исключить трудоемкие операции по разделению смесей.
Использование в спектрофотометрическом анализе комбинированного полинома позволило исключить влияние нелинейного фона и разработать методики количественного определения ряда препаратов в лекарственных формах, не требующие сложных расчетов результатов анализа. Комбинированный полином успешно применен при изучении процессов, происходящих при хранении лекарственных веществ и в химико-токсикологических исследованиях, так как позволяет уменьшить влияние светопоглощающих примесей (Е.Н.Вергейчик).
Спектроскопия комбинационного рассеяния (СКР) отличается от других спектроскопических методов по чувствительности, большому выбору растворителей и интервалов температур. Наличие отечественного КР-спектрометра марки ДСФ-24 позволяет применять этот метод не только для установления химической структуры, но и в фармацевтическом анализе.
Не получил еще должного развития в практике фармацевтического анализа метод спектрофотометрического титрования. Этот метод дает возможность выполнения безындикаторного титрования многокомпонентных смесей с близкими значениями рК на основе последовательного изменения оптической плотности в процессе титрования в зависимости от объема добавляемого титранта.
Фотоколориметрический метод широко применяется в фармацевтическом анализе. Количественное определение этим методом в отличие от УФ-спбктрофотометрии осуществляют в видимой области спектра. Определяемое вещество с помощью какого-либо реагента переводят в окрашенное соединение, а затем измеряют интенсивность окраски раствора на фотоколориметре. Точность определений зависит от выбора оптимальных условий протекания химической реакции.
Очень широко в фотометрическом анализе используются методики анализа препаратов, производных первичных ароматических аминов, основанные на использовании реакций диазотирования и азосочетания. В качестве азосоставляющего широко применяют N -(1-нафтил)-этилендиамин. Реакция образования азокрасителей лежит в основе фотометрического определения многих препаратов, производных фенолов.
Фотоколориметрический метод включен в НТД для количественного определения ряда нитропроизводных (нитроглицерин, фурадонин, фуразолидон), а также препаратов витаминов (рибофлавин,фолиевая кислота) и сердечных гликозидов (целанид). Разработаны многочисленные методики фотоколориметрического определения препаратов в лекарственных формах. Известны различные модификации фотоколориметрии и способы расчета концентрации в фотоколориметрическом анализе.
Перспективными для применения в качестве цветореагентов в фотометрическом анализе оказались такие поликарбонильные соединения, как биндон (ангидро-бис-индандион-1,3), аллоксан (тетраоксогекса-гидропиримидин), натриевая соль 2-карбэтоксииндандиона-1,3 и некоторые ее производные. Установлены оптимальные условия и разработаны унифицированные способы идентификации и спектрофотометрического определения в видимой области лекарственных веществ, содержащих первичную ароматическую или алифатическую аминогруппу, остаток сульфонил мочевины или являющимися азотсодержащими органическими основаниями и их солями (В.В.Петренко).
Широко используют в фотоколориметрии реакции окрашивания, основанные на образовании полиметиновых красителей, которые получаются при разрыве пиридинового или фуранового циклов либо при некоторых реакциях конденсации с первичными ароматическими аминами (А.С.Бейсенбеков).
Для идентификации и спектрофотометрического определения в видимой области спектра лекарственных веществ, производных ароматических аминов, тиолов, тиоамидов и других меркаптосоединений использованы в качестве цветореагентов N -хлор-, N -бензолсульфонил- и N -бензолсульфонил-2-хлор-1,4-бензохинонимина.
Один из вариантов унификации способов фотометрического анализа основан на косвенном определении по остатку нитрита натрия, вводимого в реакционную смесь в виде стандартного раствора, взятого в избытке. Избыток нитрита определяют затем фотометрически реакцией диазотирования с помощью этакридина лактата. Такой прием применен для косвенного фотометрического определения азотсодержащих лекарственных веществ по нитрит-иону, образующемуся в результате их превращений (гидролиза, термического разложения). Унифицированная методика позволяет осуществлять контроль качества более 30 таких лекарственных веществ в многочисленных лекарственных формах (П.Н.Ивахненко).
Фототурбидиметрия и фотонефелометрия - это методы, имеющие большие возможности, но пока ограниченно применяющиеся в фармацевтическом анализе. Основаны на измерении света, поглощенного (турбидиметрия) или рассеянного (нефелометрия) взвешенными частицами анализируемого вещества. С каждым годом методы совершенствуются. Рекомендуют, например, хронофототурбидиметрию в анализе лекарственных веществ. Сущность метода заключается в установлении изменений светопогашений во времени. Описано также применение термонефелометрии, основанной на установлении зависимости концентрации вещества от температуры, при которой наступает помутнение раствора препарата.
Систематические исследования в области фототурбидиметрии, хронофототурбидиметрии и фототурбидиметрического титрования показали возможность применения фосфорно-вольфрамовой кислоты для количественного определения азотсодержащих лекарственных веществ. В фототурбидиметрическом анализе использован как непосредственный, так и дифференциальный метод, а также автоматическое фототурбидиметрическое титрование и хронофототурбидиметрическое определение двухкомпонентных лекарственных форм (А.И.Сичко).
Инфракрасная (ИК) спектроскопия характеризуется широкой информативностью, что создает возможность объективной оценки подлинности и количественного определения лекарственных веществ. ИК-спектр однозначно характеризует всю структуру молекулы. Различия в химическом строении меняют характер ИК-спектра. Важные преимущества ИК-спектрофотометрии -- специфичность, быстрота выполнения анализа, высокая чувствительность, объективность получаемых результатов, возможность анализа вещества в кристаллическом состоянии.
ИК-спектры измеряют, используя обычно взвеси лекарственных веществ в вазелиновом масле, собственное поглощение которого не мешает идентификации анализируемого соединения. Для установления подлинности используют, как правило, расположенную в интервале частот от 650 до 1800 см -1 так называемую область "отпечатков пальцев" (650--1500 см -1), а также валентные колебания химических связей
С=0, С=С, С=N
В ГФ XI рекомендованы два способа установления подлинности лекарственных веществ но ИК-спектрам. Один из них основан на сравнении ИК-спектров испытуемого вещества и его стандартного образца. Спектры должны быть сняты в идентичных условиях, т.е. образцы должны быть в одинаковом агрегатном состоянии, в одной и той же концентрации, единой должна быть скорость регистрации и т.д. Второй способ заключается в сравнении ИК-спектра испытуемого вещества с его стандартным спектром. В этом случае необходимо строго соблюдать условия, предусмотренные для снятия стандартного спектра, приведенные в соответствующей НТД (ГФ, ВФС, ФС). Полное совпадение полос поглощения свидетельствует об идентичности веществ. Однако полиморфные модификации могут давать различные ИК-спектры. В таком случае для подтверждения идентичности необходимо перекристаллизовать испытуемые вещества из одного и того же растворителя и вновь снять спектры.
Подтверждением подлинности лекарственного вещества может служить также интенсивность поглощения. Для этой цели используют такие константы как показатель поглощения или величина интегральной интенсивности поглощения, равная площади, которую огибает кривая на спектре поглощения.
Установлена возможность использования ИК-спектроскопии для идентификации большой группы лекарственных веществ, содержащих в молекуле карбонильные группы. Подлинность устанавливают по характеристическим полосам поглощения в следующих областях: 1720-1760, 1424-1418, 950-в00 см -1 для карбоновых кислот; 1596-1582, 1430-1400, 1630-1612, 1528-1518 см -1 для аминокислот; 1690--1670, 1615--1580 см -1 для амидов; 1770--1670 см -1 для производных барбитуровой кислоты; 1384--1370, 1742--1740, 1050 см -1 для терпеноидов; 1680--1540, 1380--1278 см -1 для антибиотиков тетрациклинового ряда; 3580-3100, 3050-2870, 1742-1630, 903-390 см -1 для стероидов (А.Ф.Мынка).
Метод ИК-спектроскопии включен в фармакопеи многих зарубежных стран и в МФ III, где использован для идентификации более 40 лекарственных веществ. Методом ИК-спектрофотометрии можно проводить не только количественную оценку лекарственных веществ, но и исследование таких химических превращений, как диссоциация, сольволиз, метаболизм, полиморфизм и т.д.
4.4 Методы, основанные на испускании излучения
К этой группе методов относят фотометрию пламени, флуоресцентные и радиохимические методы.
В ГФ XI включена эмиссионная и пламенная спектрометрия для целей качественного и количественного определения химических элементов и их примесей в лекарственных веществах. Измерение интенсивности излучения спектральных линий испытуемых элементов выполняют на отечественных пламенных фотометрах ПФЛ-1, ПФМ, ПАЖ-1. Регистрирующими системами служат фотоэлементы, связанные с цифровыми и печатающими устройствами. Точность определений методами эмиссионной, как и атомно-абсорбционной, пламенной спектрометрии находится в пределах 1--4%, предел обнаружения может достигать 0,001 мкг/мл.
Количественное определение элементов методом эмиссионной пламенной спектрометрии (пламенной фотометрии) основано на установлении зависимости между интенсивностью спектральной линии и концентрацией элемента в растворе. Сущность выполнения испытания состоит в распылении анализируемого раствора до состояния аэрозоля в пламени горелки. Под воздействием температуры пламени происходят испарение растворителя и твердых частиц из капель аэрозоля, диссоциация молекул, возбуждение атомов и возникновение их характеристического излучения. С помощью светофильтра или монохроматора излучение анализируемого элемента отделяется от других и, попадая на фотоэлемент, вызывает фототок, который измеряется с помощью гальванометра или потенциометра.
Пламенная фотометрия использована для количественного анализа натрий-, калий- и кальций-содержащих препаратов в лекарственных формах. На основе исследования влияния на эмиссию определяемых катионов, органических анионов, вспомогательных и сопутствующих компонентов были разработаны методики количественного определения натрия гидрокарбоната, натрия салицилата, ПАСК-натрия, билигноста, гексенала, натрия нуклеината, кальция хлорида и глюконата, бепаска и др. Предложены методики одновременного определения двух солей с разными катионами в лекарственных формах, например калия иодида -- натрия гидрокарбоната, кальция хлорида -- калия бромида, калия иодида -- натрия салицилата и др.
Люминесцентные методы основаны на измерении вторичного излучения, возникающего в результате воздействия света на анализируемое вещество. К их числу относят флуоресцентные методы, хемилюминесценцию, рентгенофлуоресценцию и др.
Флуоресцентные методы основаны на способности веществ флуоресцировать в УФ-свете. Эта способность обусловлена структурой либо самих органических соединений, либо продуктов их диссоциации, сольволиза и других превращений, вызванных воздействием различных реактивов.
Флуоресцирующими свойствами обладают обычно органические соединения с симметричной структурой молекул, в которых имеются сопряженные связи, нитро-, нитрозо-, азо-, амидо-, карбоксильная или карбонильная группы. Интенсивность флуоресценции зависит от химической структуры и концентрации вещества, а также других факторов.
Флуориметрия может быть использована как для качественного, так и для количественного анализа. Количественный анализ выполняют на спектрофлуориметрах. Принцип их работы состоит в том, что свет от ртутно-кварцевой лампы через первичный светофильтр и конденсор падает на кювету с раствором испытуемого вещества. Расчет концентрации проводят по шкале стандартных образцов флуоресцирующего вещества известной концентрации.
Разработаны унифицированные методики количественного спект- рофлуориметрического определения производных п-аминобензолсульфамида (стрептоцид, сульфацил-натрий, сульгин, уросульфан и др.) и п-аминобензойной кислоты (анестезин, новокаин, новокаинамид). Водно-щелочные растворы сульфаниламидов имеют наибольшую флуоресценцию при рН б--8 и 10--12. Кроме того, сульфаниламиды, содержащие в молекуле незамещенную первичную ароматическую аминогруппу, после нагревания с о-фталевым альдегидом в присутствии серной кислоты приобретают интенсивную флуоресценцию в области 320--540 нм. В той же области флуоресцируют производные барбитуровой кислоты (барбитал, барбитал-натрий, фенобарбитал, этаминал-натрий) в щелочной среде (рН 12--13) с максимумом флуоресценции при 400 нм. Предложены высокочувствительные и специфичные методики спектрофлуориметрического определения антибиотиков: тетрациклина, окситетрациклина гидрохлорида, стрептомицина сульфата, пассомицина, флоримицина сульфата, гризеофульвина и сердечного гликозида целанида (Ф.В.Бабилев). Проведены исследования спектров флуоресценции ряда лекарственных средств, содержащих природные соединения: производные кумарина, антрахинона, флавоноидов (В.П.Георгиевский).
Выявлены комплексообразующие группировки у 120 лекарственных веществ, производных оксибензойной, оксинафтойной, антраниловой кислот, 8-оксихинолина, оксипиридина, 3- и 5-оксифлавона, птеридина и др. Указанные группировки способны образовывать флуоресцирующие комплексы с катионами магния, алюминия, бора, цинка, скандия при возбуждении флуоресценции от 330 нм и выше и ее излучении при длинах волн, превышающих 400 нм. Проведенные исследования позволили разработать методики флуориметрирования 85 лекарственных средств (А.А.Хабаров).
Наряду с производной спектрофотометрией в фармацевтическом анализе обоснована возможность применения производной спектрофлуориметрии. Спектры снимают на флуоресцентном спектрофотометре МПФ-4 с термостатирующей ячейкой, а производные находят аналогичным дифференцированием с помощью компьютера. Метод использован для разработки простых, точных и высокочувствительных методик количественного определения гидрохлоридов пиридоксина и эфедрина в лекарственных формах в присутствии продуктов разложения.
Перспективность использования рентгеновской флуоресценции для определения малых количеств примесей в лекарственных препаратах обусловливается высокой чувствительностью и возможностью выполнения анализа без предварительного разрушения вещества. Метод рентгенофлуоресцентной спектрометрии оказался перспективным для количественного анализа веществ, имеющих в молекуле такие гетероатомы, как железо, кобальт, бром, серебро и др. Принцип метода заключается в сравнении вторичного рентгеновского излучения элемента в анализируемом и стандартном образце. Рентгенофлуоресцентная спектрометрия относится к числу методов, не требующих предварительных деструктивных изменений. Выполняют анализ на отечественном спектрометре РС-5700. Продолжительность анализа 15 мин.
Хемилюминесценция -- метод, заключающийся в использовании энергии, возникающей в процессе химических реакций.
Эта энергия служит источником возбуждения. Ее излучают при окислении некоторые барбитураты (особенно фенобарбитал), гидразиды ароматических кислот и другие соединения. Это создает большие возможности использования метода для определения очень малых концентраций веществ в биологическом материале.
Радиохимические методы находят все более широкоеприменение в фармацевтическоманализе. Радиометрический анализ, основанный на измерении?- или?-излучения с помощью спектрометров, использован (наряду с другими параметрами для оценки качества фармакопейных радиоактивных препаратов. Широко применяют в различных областях техники и особенно в аналитической химии высокочувствительные методы анализа с применением радиоактивных изотопов (меченых атомов). Для обнаружения следов примесей в веществах используют активационный анализ; для определения в смесях близких по свойствам трудноразделяемых компонентов -- метод изотопного разбавления. Применяют также радиометрическое титрование и радиоактивные индикаторы. Оригинальным вариантом сочетания радиоизотопного и хроматографического методов является изучение диффузионно-осадочных хроматограмм в тонком слое желатинового геля с помощью радиоактивных индикаторов.
4.5 Методы, основанные на использовании магнитного поля
Методы ЯМР-, ПМР-спектроскопии, а также масс-спектрометрии отличаются высокой специфичностью, чувствительностью и используются для анализа многокомпонентных смесей, в том числе лекарственных форм без предварительного их разделения.
Метод спектроскопии ЯМР используют для испытания подлинности лекарственных веществ, которая может быть подтверждена либо по полному набору спектральных параметров, характеризующих структуру данного соединения, либо по наиболее характерным сигналам спектра. Подлинность можно также установить с помощью стандартного образца, добавляя определенное его количество к анализируемому раствору. Полное совпадение спектров анализируемого вещества и его смеси со стандартным образцом указывает на их идентичность.
Регистрацию ЯМР-спектров выполняют на спектрометрах с рабочими частотами 60 мГц и более, используя такие основные характеристики спектров, как химический сдвиг, мультиплетность сигнала резонанса, константу спин-спинового взаимодействия, площадь сигнала резонанса. Наиболее обширную информацию о молекулярной структуре анализируемого вещества дают спектры ЯМР 13 С и 1 Н.
Надежная идентификация препаратов гестагенных и эстрогенных гормонов, а также их синтетических аналогов: прогестерона, прегнина, этинилэстрадиола, метилэстрадиола, эстрадиола дипропионата и др. -- может быть осуществлена методом спектроскопии ЯМР 1 Н в деитерированном хлороформе на спектрометре УН-90 с рабочей частотой 90 мГц (внутренний стандарт -- тетраметилсилан).
Систематические исследования позволили установить возможность применения спектроскопии ЯМР 13 С для идентификации лекарственных веществ 10-ацилпроизводных фенотиазина (хлорацизина, фторацизина, этмозина, этацизина), 1,4-бензодиазепина (хлор-, бром- и нитропроизводные) и др. Методом спектроскопии ЯМР 1 Н и 13 С осуществлены идентификация, количественная оценка основных компонентов и примесей в препаратах и стандартных образцах природных и полусинтетических антибиотиков аминогликозидов, пенициллинов, цефалоспоринов, макролидов и др. Указанный метод использован для идентификации в унифицированных условиях ряда витаминов: липоевой и аскорбиновой кислот, липамида, холина и метилметионинсульфония хлоридов, ретинола пальмитата, кальция пантотената, эргокальциферола. Метод спектроскопии ЯМР 1 Н позволил осуществлять надежную идентификацию таких сложных по химической структуре природных соединений, как сердечные гликозиды (дигоксин, дигитоксин, целанид, дезланозид, нериолин, цимарин и др.). Для ускорения обработки спектральной информации использована ЭВМ. Ряд методик идентификации включен в ФС и ВФС (В.С.Карташов).
Количественное определение лекарственного вещества может быть также выполнено с использованием спектров ЯМР. Относительная погрешность количественных определений методом ЯМР зависит от точности измерений площадей резонансных сигналов и составляет ±2--5%. При определении относительного содержания вещества или его примеси измеряют площади сигналов резонанса испытуемого вещества и стандартного образца. Затем вычисляют количество испытуемого вещества. Для определения абсолютного содержания лекарственного вещества или примеси анализируемые образцы готовят количественно и добавляют к навеске точно отвешенную массу внутреннего стандарта. После этого выполняют регистрацию спектра, измеряют площади сигналов анализируемого вещества (примеси) и внутреннего стандарта, затем вычисляют абсолютное содержание.
Развитие импульсной техники Фурье-спектроскопии, применение ЭВМ позволили резко повысить чувствительность метода ЯМР 13 С и распространить его на количественный анализ многокомпонентных смесей биоорганических соединений, в том числе лекарственных веществ без их предварительного разделения.
Спектроскопические параметры ПМР-спектров дают целый комплекс разнообразной и весьма селективной информации, который может быть использован в фармацевтическом анализе. Следует строго соблюдать условия регистрации спектров, так как на значения химических сдвигов и другие параметры оказывают влияние тип растворителя, температура, рН раствора, концентрация вещества.
Если полная интерпретация ПМР-спектров затруднена, то выделяют только характерные сигналы, по которым идентифицируют испытуемое вещество. ПМР-спектроскопия применена для испытания подлинности многих лекарственных веществ, в том числе барбитуратов, гормональных средств, антибиотиков и др.
Поскольку метод дает информацию о наличии или отсутствии примесей к основному веществу, важное практическое значение имеет ПМР-спектроскопия для испытания лекарственных веществ на чистоту. Различия в значениях величин тех или иных констант позволяют сделать заключение о присутствии примесей продуктов разложения лекарственного вещества. Чувствительность метода к примесям колеблется в широких пределах и зависит от спектра основного вещества, наличия в молекулах тех или иных групп, содержащих протоны, растворимости в соответствующих растворителях. Минимальное содержание примеси, которое можно установить, составляет обычно 1--2%. Особенно ценной является возможность обнаружения примесей изомеров, присутствие которых невозможно подтвердить другими методами. Так, например, обнаружена примесь кислоты салициловой в кислоте ацетилсалициловой, морфина в кодеине и т.д.
Количественный анализ на основе использования ПМР-спектроскопии имеет преимущества перед другими методами, заключающиеся в том, что при анализе многокомпонентных смесей нет необходимости выделять индивидуальные компоненты для калибровки прибора. Поэтому метод широко применим для количественного анализа как индивидуальных лекарственных веществ, так и растворов, таблеток, капсул, суспензий и других лекарственных форм, содержащих один или несколько ингредиентов. Стандартное отклонение не превышает ±2,76%. Описаны способы анализа таблеток фуросемида, мепробамата, хинидина, преднизолона и др.
Расширяется диапазон применения масс-спектрометрии в анализе лекарственных веществ для идентификации и количественного анализа. Метод основан на ионизации молекул органических соединений. Он отличается большой информативностью и исключительно высокой чувствительностью. Масс-спектрометрию применяют для определения антибиотиков, витаминов, пуриновых оснований, стероидов, аминокислот и других лекарственных веществ, а также продуктов их метаболизма.
Использование лазеров в аналитических приборах значительно расширяет практическое применение УФ- и ИК-спектрофотометрии, а также флуоресцентной и масс-спектроскопии, спектроскопии комбинационного рассеяния, нефелометрии и других методов. Лазерные источники возбуждения позволяют повысить чувствительность многих методов анализа, сократить продолжительность их выполнения. Лазеры используют в дистанционном анализе в качестве детекторов в хроматографии, в биоаналитической химии и т.д.
4.6 Электрохимические методы
Эта группа методов качественного и количественного анализа основана на электрохимических явлениях, происходящих в исследуемой среде и связанных с изменениями химической структуры, физических свойств или концентрации веществ.
Потенциометрия -- метод, основанный на измерении равновесных потенциалов, возникающих на границе между испытуемым раствором и погруженным в него электродом. В ГФ XI включен метод потенциометрического титрования, заключающийся в установлении эквивалентного объема титранта путем измерения ЭДС индикаторного электрода и электрода сравнения, погруженных в анализируемый раствор. Метод прямой потенциометрии используется для определения рН (рН-метрия) и установления концентрации отдельных ионов. Потенциометрическое титрование отличается от индикаторного возможностью анализировать сильно окрашенные, коллоидные и мутные растворы, а также растворы, содержащие окислителй. Кроме того, можно последовательно оттитровать в смеси несколько компонентов в водных и неводных средах. Потенциометрический метод используют для титрования на основе реакций нейтрализации, осаждения, комплексообразования, окисления -- восстановления. Электродом сравнения во всех указанных методах служит каломельный, хлорсеребряный или стеклянный (последний не используют при анализе методом нейтрализации). Индикаторным при кислотно-основном титровании является стеклянный электрод, при комплексонометрическом -- ртутный или ион-селективный, в методе осаждения -- серебряный, в окислительно-восстановительном -- платиновый.
Измерение ЭДС, возникающей при титровании за счет разности потенциалов между индикаторным электродом и электродом сравнения, производят с помощью высокоомных рН-метров. Титрант прибавляют из бюретки равными объемами, постоянно перемешивая титруемую жидкость. Вблизи точки эквивалентности титрант прибавляют по 0,1--0,05 мл. Значение ЭДС в этой точке изменяется наиболее сильно, так как абсолютная величина отношения изменения ЭДС к приращению объема прибавляемого титранта будет при этом максимальной. Результаты титрования представляют либо графически, устанавливая точку эквивалентности на кривой титрования, либо расчетным методом. Затем вычисляют эквивалентный объем титранта по формулам (см. ГФ XI, вып. 1, с. 121).
Амперометрическое титрование с двумя индикаторными электродами, или титрование "до полного прекращения тока", основано на использовании пары идентичных инертных электродов (платина, золото), которые находятся под небольшим напряжением. Метод наиболее часто используют для нитрито- и иодометрического титрования. Точку эквивалентности находят по резкому увеличению силы тока, проходящего через ячейку (в течение 30 с) после добавления последней порции реагента. Эту точку можно установить графическим методом по зависимости силы тока от объема добавленного реагента, так же как при потенциометрическом титровании (ГФ XI, вып. 1, с. 123). Разработаны также способы биамперометрического титрования лекарственных веществ при использовании методов нитритометрии, осаждения и окисления -- восстановления.
Особенно перспективна ионометрия, использующая зависимость между ЭДС гальванической сети с ионоселективным электродом и концентрацией анализируемого иона в электродной ячейке цепи. Определения неорганических и органических (азотсодержащих) лекарственных веществ с помощью ионоселективных электродов отличаются от других методов высокой, чувствительностью, экспрессностью, хорошей воспроизводимостью результатов, несложным оборудованием, доступными реагентами, пригодностью для автоматизированного контроля и исследования механизма действия лекарств. В качестве примера можно привести способы ионометрического определения калия, натрия, галогенидов и кальцийсодержащих лекарственных веществ в таблетках и в солевых кровезамещающих жидкостях. С помощью отечественных рН-метров (рН-121, рН-673), ионометра И-115 и калий селективных электродов определяют калиевые соли различных кислот (оротовой, аспарагиновой и др.).
Полярография -- метод анализа, основанный на измерении силы тока, возникающего на микроэлектроде при электровосстановлении или электроокислении анализируемого вещества в растворе. Электролиз проводят в полярографической ячейке, которая состоит из электролизера (сосуда) и двух электродов. Один из них -- ртутный капающий микроэлектрод, а другой -- макроэлектрод, которым служит либо слой ртути на электролизере, либо внешний насыщенный каломельный электрод. Полярографический анализ может быть выполнен в водной среде, в смешанных растворителях (вода -- этанол, вода -- ацетон), в неводных средах (этаноле, ацетоне, диметилформамиде и др.). При идентичных условиях измерений для идентификации вещества используют потенциал полуволны. Количественное определение основано на измерении предельного диффузного тока испытуемого лекарственного вещества (высота волны). Для определения содержания используют метод калибровочных кривых, метод стандартных растворов и метод добавок (ГФ XI, вып. 1, с. 154). Полярографию широко используют в анализе неорганических веществ, а также алкалоидов, витаминов, гормонов, антибиотиков, сердечных гликозидов. Весьма перспективны вследствие высокой чувствительности современные методы: дифференциальная пульс-полярография, осциллографическая полярография и др.
Далеко не исчерпаны возможности электрохимических методов в фармацевтическом анализе. Разрабатываются новые варианты потенциометрии: инверсионная бестоковая хронопотенциометрия, прямая потенциометрия с помощью газового аммоний-селективного электрода и др. Расширяются исследования в области применения в фармацевтическом анализе таких методов, как кондуктометрия, основанная на исследовании электрической проводимости растворов анализируемых веществ; кулонометрия, заключающаяся в измерении количества электричества, затраченного на электрохимическое восстановление или окисление определяемых ионов.
Кулонометрия имеет ряд преимуществ перед другими физико-химическими и химическими методами. Поскольку этот метод основан на измерении количества электричества, он дает возможность непосредственно определять массу вещества, а не какое-либо свойство, пропорциональное концентрации. Вот почему кулонометрия исключает необходимость использования не только стандартных, но и титрованных растворов. Что касается кулонометрического титрования, то оно расширяет область титриметрии за счет применения различных неустойчивых электрогенерированных титрантов. Одна и та же электрохимическая ячейка может быть использована для проведения титрования с использованием различных типов химических реакций. Так, методом нейтрализации можно опредачить кислоты и основания даже в миллимолярных растворах с погрешностью не более 0,5%.
Кулонометрический метод применяют при определении малых количеств анаболических стероидов, местно-анестезирующих и других лекарственных веществ. Определению не мешают наполнители таблеток. Методики отличаются простотой, экспрессностью, быстротой и чувствительностью.
Метод диэлектрических измерений в диапазоне электромагнитных волн широко применяют для экспресс-анализа в химической технологии, пищевой промышленности и других областях. Одним из перспективных направлений является диэлькометрический контроль ферментных и других биопрепаратов. Он позволяет осуществить быструю, точную, безреагентную оценку таких параметров, как влажность, степень гомогенности и чистоты препарата. Диэлькометрический контроль является многопараметровым, испытуемые растворы могут быть непрозрачными, а измерения можно выполнять бесконтактным способом с записью результатов на ЭВМ.
4.7 Методы разделения
Из физико-химических методов разделения в фармацевтическом анализе в основном используют хроматографию, электрофорез и экстракцию.
Хроматографические методы разделения веществ основаны на их распределении между двумя фазами: подвижной и неподвижной. Подвижной фазой может быть жидкость или газ, неподвижной -- твердое вещество или жидкость, адсорбированная на твердом носителе. Относительная скорость перемещения частиц вдоль пути разделения зависит от взаимодействия их с неподвижной фазой. Это приводит к тому, что каждое из веществ проходит определенную длину пути на носителе. Отношение скорости перемещения вещества к скорости перемещения растворителя обозначают Эта величина является константой вещества для данных условий разделения и используется для идентификации.
Хроматография дает возможность наиболее эффективно осуществлять избирательное распределение компонентов анализируемого образца. Это имеет существенное значение для фармацевтического анализа, объектами исследования в котором обычно являются смеси нескольких веществ.
По механизму процесса разделения хроматографические методы классифицируют на ионообменную, адсорбционную, осадочную, распределительную, окислительно-восстановительную хроматографию. По форме проведения процесса можно выделить колоночную, капиллярную и плоскостную хроматографию. Последняя может быть выполнена на бумаге и в тонком (закрепленном или незакрепленном) слое сорбента. Хроматографические методы классифицируют также по агрегатно- му состоянию анализируемого вещества. К ним относятся различные методы газовой и жидкостной хроматографии.
Адсорбционная хроматография основана на избирательной адсорбции отдельных компонентов из раствора смеси веществ. Стационарной фазой служат такие адсорбенты, как оксид алюминия, активированный уголь и др.
Ионообменная хроматография использует ионообменные процессы, происходящие между адсорбентом и ионами электролита в анализируемом растворе. Стационарной фазой служат катион обменные или ани- онобменные смолы, содержащиеся в них ионы способны обмениваться на одноименно заряженные противоионы.
Осадочная хроматография основана на различии в растворимости веществ, образующихся при взаимодействии компонентов разделяемой смеси с осадителем.
Распределительная хроматография заключается в распределении компонентов смеси между двумя несмешивающимися жидкими фазами (подвижной и неподвижной). Стационарной фазой служит пропитанный растворителем носитель, а подвижной фазой -- органический растворитель, практически не смешивающийся с первым растворителем. При выполнении процесса в колонке происходит разделение смеси на зоны, содержащие по одному компоненту. Распределительная хроматография может выполняться также в тонком слое сорбента (тонкослойная хроматография) и на хроматографической бумаге (бумажная хроматография).
Ранее других методов разделения в фармацевтическом анализе йачали применять ионообменную хроматографию для количественного определения препаратов: солей серной, лимонной и других кислот. При этом ионообменную хроматографию сочетают с кислотно-основным титрованием. Совершенствование метода позволило, используя хроматографию ионных пар с обращенной фазой, разделять некоторые гидрофильные органические соединения. Возможно сочетание комплексонометрии с использованием катионитов в Zn 2+ -фopмe для анализа аминопроизводных в смесях и алкалоидов в экстрактах и настойках. Таким образом, сочетание ионообменной хроматографии с другими методами расширяет область ее применения.
В 1975 г. предложен новый вариант хроматографии, применяемый для определения ионов и названный ионной хроматографией. Для выполнения анализа используют колонки размером 25 Х 0,4 см. Разработана двухколоночная и одноколоночная ионная хроматография. Первая основана на ионообменном разделении ионов на одной колонке с последующим снижением фонового сигнала элюента на второй колонке и кондуктометрическим детектированием, а вторая (без подавления фонового сигнала элюента) сочетается с фотометрическим, атомно-абсорбционным и другими методами детектирования определяемых ионов.
Несмотря на ограниченное число работ по использованию ионной хроматографии в фармацевтическом анализе, очевидна перспективность этого метода для одновременного определения анионного состава многокомпонентных лекарственных форм и солевых растворов для инъекций (содержащих сульфат-, хлорид-, карбонат-, фосфат-ионы), для количественного определения гетероэлементов в органических лекарственных веществах (содержащих галогены, серу, фосфор, мышьяк), для определения уровня загрязнения воды, используемой в фармацевтической промышленности, различными анионами, для определения некоторых органических ионов в лекарственных формах.
Достоинствами ионной хроматографии являются высокая селективность определения ионов, возможность одновременного определен я органических и неорганических ионов, низкий предел обнаружена (до 10 -3 и даже 10 -6 мкг/мл), малый объем проб и простота их подготовки, быстрота выполнения анализа (за 20 мин возможно разделение до 10 ионов), простота аппаратурного обеспечения, возможность сочетания с другими аналитическими методами и расширение области применения хроматографии в отношении объектов, сходных по химической структуре и трудно разделяемых методами ТСХ, ГЖХ, ЖХВД.
Наиболее широко в фармацевтическом анализе используют хроматографию на бумаге и хроматографию в тонком слое сорбента.
В бумажной хроматографии стационарной фазой служит поверхность специальной хроматографической бумаги. Распределение веществ происходит между водой, находящейся на поверхности бумаги, и подвижной фазой. Последняя представляет собой систему, включающую несколько растворителей.
В фармацевтическом анализе при выполнении испытаний методом бумажной хроматографии руководствуются указаниями ГФ XI, вып. 1 (с. 98) и частных фармакопейных статей на соответствующие лекарственные вещества (лекарственные формы). При испытаниях подлинности хроматографируют на одном листе хроматографической бумаги одновременно испытуемое вещество и соответствующий стандартный образец. Если оба вещества идентичны, то соответствующие им пятна имеют на хроматограммах одинаковый вид и равные значения R f . Если хроматографировать смесь испытуемого вещества и стандартного образца, то при их идентичности на хроматограмме должно появляться только одно пятно. Чтобы исключить влияние условий хроматографирования на получаемые значения R f , можно пользоваться более объективной величиной R S , которая представляет собой отношение величин R f испытуемого и стандартного образцов.
При испытании на чистоту о наличии примесей судят по величине и интенсивности окраски пятен на хроматограмме. Примесь и основное вещество должны иметь разные значения R f Для полуколичественного определения содержания примеси на одном листе бумаги одновременно в одинаковых условиях получают хроматограмму испытуемого вещества, взятого в определенном количестве, и несколько хроматограмм стандартного образца, взятых в точно отмеренных количествах. Затем сравнивают между собой хроматограммы испытуемого и стандартного образцов. Заключение о количестве примеси делают по величине пятен и их интенсивности.
Подобные документы
Специфические особенности фармацевтического анализа. Испытание на подлинность лекарственных препаратов. Источники и причины недоброкачественности лекарственных веществ. Классификация и характеристика методов контроля качества лекарственных веществ.
реферат , добавлен 19.09.2010
Критерии фармацевтического анализа, общие принципы испытаний подлинности лекарственных веществ, критерии доброкачественности. Особенности экспресс-анализа лекарственных форм в условиях аптеки. Проведение экспериментального анализа таблеток анальгина.
курсовая работа , добавлен 21.08.2011
Государственное регулирование в сфере обращения лекарственных средств. Фальсификация лекарственных препаратов как важная проблем сегодняшнего фармацевтического рынка. Анализ состояния контроля качества лекарственных препаратов на современном этапе.
курсовая работа , добавлен 07.04.2016
Состояние маркетинговых исследований фармацевтического рынка ЛС. Методы анализа ассортимента лекарственных средств. Товароведческая характеристика винпоцетина. Анализ препаратов для улучшения мозгового кровообращения, разрешенных к применению в стране.
курсовая работа , добавлен 03.02.2016
Применение антибиотиков в медицине. Оценка качества, хранение и отпуск лекарственных форм. Химические строение и физико-химические свойства пенициллина, тетрациклина и стрептомицина. Основы фармацевтического анализа. Методы количественного определения.
курсовая работа , добавлен 24.05.2014
Классификация лекарственных форм и особенности их анализа. Количественные методы анализа однокомпонентных и многокомпонентных лекарственных форм. Физико-химические методы анализа без разделения компонентов смеси и после предварительного их разделения.
реферат , добавлен 16.11.2010
История развития технологии лекарственных форм и аптечного дела в России. Роль лекарств в лечении заболеваний. Правильный прием лекарственных препаратов. Способ применения и дозы. Профилактика болезней с использованием медикаментов, рекомендации врача.
презентация , добавлен 28.11.2015
Система анализа маркетинговой информации. Отбор источников информации. Анализ ассортимента аптечной организации. Характерные черты рынка лекарственных препаратов. Принципы сегментирования рынка. Основные механизмы действия противовирусных препаратов.
курсовая работа , добавлен 09.06.2013
Понятие вспомогательных веществ как фармацевтического фактора; их классификация в зависимости от происхождения и назначения. Свойства стабилизаторов, пролонгаторов и корригентов запаха. Номенклатура вспомогательных веществ в жидких лекарственных формах.
реферат , добавлен 31.05.2014
Комбинированное действие лекарственных веществ. Синергизм и его основные виды. Понятие антагонизма и антидотизма. Фармацевтическое и физико-химическое взаимодействие лекарственных средств. Основные принципы взаимодействия лекарственных веществ.